水稻（dào）基（jī）因靶向敲入效率增高方便育種

本（běn）報訊 中國科學院（yuàn）分子植物科（kē）學創新中（zhōng）心研究員朱健康團隊采用修飾後的DNA片段作為供體，在水稻上建立了一種片段靶向敲入和替換技術，高達（dá）近50%的靶向敲入效率將地方便植（zhí）物的研究和育種。相關研（yán）究成果近日在線發表於《自然—生物技術》。

此前，CRISPR/Cas介導的植物基因（yīn）組定點敲除技術隻能在（zài）基因組特定位點產生（shēng）隨機插（chā）入和刪除，片段插入和替換的效率一直（zhí）很低，限製了其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立植物基因組片段插入和替換技術體係。

朱健康研究組通過嚐試，發現將供體（tǐ）片段同時進行硫代修飾和磷（lín）酸化修飾後（hòu），能增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入效率。研究團隊先後在14個（gè）基因位點上成功靶向敲入了各類（lèi）調控元件，包括翻譯增強（qiáng）子、轉錄調控元件，甚至整個啟（qǐ）動子，供體片段長達（dá）2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻植株的（de）分析發現，該方法的敲入效率可高達47.3%，平均效率（lǜ）為25%。如此高的敲入效率（lǜ）甚（shèn）至（zhì）可以同時（shí）在四個位點上（shàng）實現多基因靶向敲（qiāo）入。

研究人員預計，該技術的建立將使靶向敲入成為（wéi）一項和靶向敲除一樣的常規實驗，被各個（gè）植物研究和育種單位廣泛應用。

同時，研究人員（yuán）又巧妙地設計了一種片段替換的策略，稱之為重複片段介導的同源（yuán）重組（TR-HDR）方法。常規的HDR頻率極其低下，但他們在前期的（de）實驗中發（fā）現，基因組（zǔ）上串聯重複片（piàn）段間的（de）HDR頻率非常高。他們利用這（zhè）一現象，通過將修飾的片段靶向敲入目標位點，人為製造這種（zhǒng）串聯重複結構，誘導（dǎo）TR-HDR去實現片段替換。采用該技術，他們在五個基因位點（diǎn）上實現了片段替換和原位的Flag標（biāo）簽蛋白融合（hé），效率高（gāo）達到了11.4%。這一技術突破（pò）將有助於植物學研究，農作物定向遺傳改（gǎi）良的進程。

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