水稻基因靶向敲入效率增高方便育種

本報訊 中國科學院分（fèn）子植物科學創新中心研究（jiū）員朱（zhū）健康（kāng）團隊采用修飾後的（de）DNA片段作為供體，在水稻上（shàng）建立了一種片段靶向（xiàng）敲（qiāo）入和替換技術，高達近50%的（de）靶向敲入效率將地方便植物的研究（jiū）和育（yù）種。相關研（yán）究成果（guǒ）近日在線發表於《自（zì）然—生物技術》。

此前，CRISPR/Cas介導的植物（wù）基因組定點敲除技術隻能在基因組特定位點產生隨機插入和刪除，片段插入和替換的效率一直很（hěn）低，限製了（le）其在植物研究和育種上的應用。因此，迫切需要建立植物基因組片段插入和替換技術體（tǐ）係。

朱健（jiàn）康研究組通過嚐試，發現將供體片段同時進行硫代修飾和磷酸（suān）化修飾後，能增強CRISPR/Cas9引導的靶向敲入（rù）效率。研（yán）究團（tuán）隊先後（hòu）在14個基因位點上成功靶向敲入了各類調控元件，包括翻譯增強子、轉錄調控元件，甚至整個啟動子，供體片段長（zhǎng）達2049bp。通過對1393株各類T0代基因編輯水稻（dào）植株的分析發現，該方法的（de）敲入效率可高達47.3%，平均效率（lǜ）為（wéi）25%。如此高的敲入效率甚至（zhì）可以同時在四個位點上實現多基因靶（bǎ）向敲入。

研究人員預計，該技（jì）術的建立將使靶向敲入成（chéng）為（wéi）一項和靶向敲除一樣的常規（guī）實驗，被各個植（zhí）物研（yán）究和育種單位廣泛應用。

同時，研究人員又巧妙地設計了一種片段替換的策略，稱之為（wéi）重複片（piàn）段（duàn）介導的同源（yuán）重（chóng）組（zǔ）（TR-HDR）方法。常規的HDR頻率極（jí）其低下，但他們在（zài）前（qián）期的實驗中發現，基因組上串聯重複片段（duàn）間的HDR頻率非常高。他們利用這一現象（xiàng），通過將修飾的片段靶向敲（qiāo）入目標位點，人為製造這種串（chuàn）聯重複結構，誘導TR-HDR去實現片段替換。采用該技術，他們在五（wǔ）個基因（yīn）位點上（shàng）實現了片段替換和（hé）原位的Flag標簽蛋白融合，效率（lǜ）高達到了11.4%。這（zhè）一技術突破將有助（zhù）於植物學研究，農（nóng）作物定（dìng）向遺傳改良的進程。

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